Kefir danesinden izole edilen Kluyveromyces marxianus'dan üretilen β-galaktosidaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Süleyman Demirel Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Seda Özarslan
Danışman: Tuğba Kök Taş
Özet:
Son yıllarda enzim endüstrisine olan ilgi birçok alanda kullanılmalarından dolayı giderek artmaktadır. Gerçek kefir, kefir daneleri kullanılarak üretilmektedir. Kefir danesi, geniş bakteri grubu ve mayaları kapsayan çok özel kompleks bir yapıdır. Kluyveromyces marxianus kefirde bulunan önemli bir mayadır ve birden fazla enzim üretme yeteneğine sahiptir. Bu enzimlerden biri olan β-galaktosidaz, son yıllarda uygulama alanı artan ve ticari olarak önemli olan enzimlerden birisidir. Bu tez çalışmasında kefir danesinden izole edilen Kluyveromyces marxianus kullanılarak β-galaktosidaz üretimi; sıcaklık (25-27-30-33-35-37 °C ), pH ( 4.0-7.0-8.0) ve süre (12-24-36-48-60 saat) bakımından optimize edilmiştir. Enzim üretimi boyunca fermantasyon ortamında laktoz, glukoz, galaktoz, laktik asit ve etanol konsantrasyonlarında meydana gelen değişim yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak tespit edilmiştir. Optimum şartlarda üretilen β-galaktosidaz, iyon değişim (HiTrap DEAE Sepharose FF) ve afinite kromatografisi (HisTrap FF) yöntemleri ile kısmi olarak saflaştırılmıştır. Kısmi saflaştırılan enzim optimum pH ve sıcaklık, pH ve sıcaklık stabilitesi ve Km-Vmax sabitleri yönünden karakterize edilmiştir. β-galaktosidaz üretimi için optimum koşullar pH 8.0, 30°C ve 48. saat olarak belirlenmiştir. Fermantasyonun başında ortamda bulunan laktozun fermantasyon boyunca kullanıldığı ve 60. saatte en düşük konsatrasyona ulaştığı görülmüştür. Fermantasyonun başında tespit edilemeyen glukoz, 36. saatte en yüksek konsantrasyona ulaşmış ve daha sonra giderek azalmıştır. Galaktoz ise 24. saatten sonra tamamen tüketilmiştir. Laktik asit 24. saatinde en yüksek konsantrasyona ulaşmış ve fermantasyon boyunca azalmaya devam etmiştir. Etanol ise en yüksek konsantrasyonuna 36. saatte ulaşmış ve diğer saatlerde tüketilmeye devam etmiştir. Saflaştırma işlemlerinden sonra enzim % 87.77 verimle 6.27 kat saflaştırılmış ve spesifik enzim aktivitesi 296.87 U/mg olarak belirlenmiştir. Enzimin optimum pH'sı 6.0 ve sıcaklığının 40°C olduğu aynı pH ve sıcaklık değerlerinde stabilitesini koruduğu görülmüştür. Subtrat olarak ONPG kullanılarak, enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.116 mM, 129.87 U/ml olarak belirlenmiştir. Enzim molekül ağırlığı SDS-PAGE tekniği ile belirlenmiştir. Elde edilen veriler değerlendirildiğinde bu çalışmada saflaştırdığımız β-galaktosidaz 15 dakikalık reaksiyon sonrasında % 83.1 verimle çalışarak laktozu hidrolize etmiştir. Doğal bir maya olan Kluyveromyces marxianus'un optimum pH ve sıcaklık parametreleri ile β-galaktosidazın süt ve süt ürünleri endüstrisinde kullanılabileceği ve biyo-etanol üreticisi olduğu sonucuna varılmıştır.